年4月16日，北京大学张泽民教授团队在Cell发表研究性论文，通过对结直肠癌患者的肿瘤微环境和小鼠肿瘤模型进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），解析了结直肠癌浸润髓系细胞的特征，揭示了CSF1R阻断和anti-CD40激动型抗体这两种靶向髓系细胞免疫治疗策略的潜在作用机理。
背景介绍
迄今为止，多种增强抗肿瘤免疫治疗的策略已被提出，包括免疫检查点阻断（ICB）、消耗肿瘤微环境（TME）中的免疫抑制性细胞及使用激动性抗体激活特定免疫细胞亚群等。然而，由于我们对TME复杂性的了解并不充分，导致许多此类策略即使被推广到临床，也不是根据明确的机制来进行选择的结果。单细胞RNA测序（scRNA-seq）可用于表征细胞的多样性和异质性，在肿瘤中该技术可以应用于解析肿瘤细胞及其微环境中浸润性免疫细胞的复杂性。张泽民教授团队于年在Nature首次刻画了结直肠癌中20类具有不同功能特性的T细胞亚群及其动态变化，从单细胞组学角度揭示了基因组微卫星稳定和不稳定患者的T细胞差异。
除了肿瘤浸润淋巴细胞，单细胞分析还用于揭示肿瘤浸润髓系细胞的复杂性，包括肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和树突状细胞（DCs）。TAMs可以通过产生肿瘤和血管生长因子、细胞外基质（ECM）重塑和免疫抑制来促进肿瘤的转移和扩散，如今，通过阻断CSF1R及其配体CSF1和IL-34之间的相互作用来阻断巨噬细胞扩增和分化的靶向疗法已经进入临床试验。在肿瘤微环境中，DCs虽只占髓样细胞的少数，但却是抗肿瘤T细胞反应的关键协调者。根据独特的表型标记和不同的功能，经典DC（cDC）可以分为两个亚群（cDC1和cDC2），其中cDC2在肿瘤中的作用仍不明确，而cDC1被证明具有将肿瘤相关抗原交叉呈递至CD8+T细胞的能力，对于产生抗肿瘤T细胞反应至关重要。通过激活CD40受体的DC靶向治疗策略也已进入临床试验，然而，这些靶向髓系细胞免疫治疗的作用机理尚未得到全面解释。
本文中，作者联合两个scRNA-seq平台（Smart-Seq2和10×Genomics）对肿瘤、邻近正常组织和结直肠癌（CRC）患者血液中的免疫细胞群和基质细胞群进行了高分辨率分析，进一步构建了细胞-细胞相互作用网络，确定了TAMs和DCs是参与调控抗肿瘤免疫的关键细胞群且处于相互作用网络的中心；基于这个结果，在CSF1R阻断和anti-CD40免疫治疗的背景下，作者进行了scRNA-seq以鉴定小鼠肿瘤模型中的类似关键细胞群；通过对CRC患者和小鼠模型的单细胞测序结果进行结合分析，揭示了这些关键细胞的异质性及其靶向治疗的功能机制，为研究其他疾病中免疫细胞参与的调控机制以及开发新的免疫治疗方案提供了思路。
主要发现
1.scRNA-seq分析确定了CRC患者与小鼠肿瘤模型中保守的浸润髓系细胞亚群。
2.C1QC+TAM和SPP1+TAM细胞群分别显示炎性（inflammatory）和血管生成（angiogenic）相关的标签。
3.C1QC+TAM和SPP1+TAM细胞群显示对CSF1R阻断的不同敏感性。
4.Anti-CD40激活特定的cDC1并显著富集Bhlhe40+Th1细胞和CD8+记忆T细胞。
实验结果
1.基于Smart-seq2和10×Genomics的scRNA-seq鉴定CRC患者瘤内细胞类型
作者首先从18位未接受过治疗的CRC患者的肿瘤、邻近的正常组织和血液中分选收集了CD45+和CD45-细胞，然后使用10×和Smart-Seq2这两种单细胞测序技术，分别获得了43,个（10×）和10,个（Smart-seq2）单细胞转录组。与10×平台相比，Smart-seq2平台捕获了更多的基因，包括细胞因子，CD分子，配体/受体和转录因子，并且显示出较弱的批次效应。
通过对这两组数据进行聚类分析，确定了大多数已知的免疫细胞类型，包括髓系细胞，先天淋巴样细胞（ILCs），T细胞和B细胞，进一步的无监督聚类分析显示10×和Smart-seq2平台分别产生了38个和36个白细胞簇（Figure1A）。接着作者通过逻辑回归建模，定义了这两组聚类数据的相似性。对于淋巴细胞，两个平台都捕获了相似的B细胞和ILCs（包括血液、组织富集的NK细胞和正常粘膜组织富集的ILC3细胞）；与淋巴细胞相反，髓样细胞在这两个平台之间表现出了较大程度的差异，两个中间型单核细胞亚群（hM07和hM11）主要被10×平台捕获（Figure1B），表明每位患者可能需要更多数量的测序细胞才能鉴定稀有或转移的细胞群。最终，作者从这两个平台获得了13个髓样细胞簇，4个ILC簇，18个T细胞簇和5个B细胞簇，将所有的细胞簇进行t-SNE分析可视化（Figure1C），可以看到每个簇由来自多个不同患者的细胞组成，并与不同的组织分布模式相关。
综上所述，尽管Smart-seq2平台捕获了更多的基因，可以对调节途径进行更深入的分析，但10×平台有效地获得了更多的细胞簇。因此，作者利用Smart-seq2的基因深度和10×scRNA-seq的细胞覆盖率这两个平台的独特优势来定义肿瘤浸润性髓样细胞的特性以及它们与CRC中其他细胞的相互作用。
Figure1.IdentificationofIntratumoralCellTypesinHumanCRCbySmart-seq2and10×GenomicsscRNA-seq
2.利用scRNA-seq在CRC患者中表征肿瘤浸润性髓样细胞
作者首先剖析了获得的13个髓细胞亚群的基因特征（Figure2A-C）。在这些细胞簇中，肥大细胞（hM01）表达了一组独特的基因，如TPSAB1/2，CPA3，MS4A2和KIT，且在肿瘤和正常粘膜中被富集，这种表达分布特征与它们保持肠道菌群稳态和调节CRC炎症反应的作用相符；接下来作者根据高表达HLA-DRs和低表达CD14的特征来鉴定DC细胞群，并进一步根据LILRA4/LILRB4，CD1C/FCER1A和XCR1/BATF3的特异性表达区分了pDC（hM02），cDC2（hM03）和cDC1（hM04）这三类DC亚群，且发现它们在CRC肿瘤和正常粘膜中均表现出相似的富集；三类在血液中富集的单核细胞簇（经典型hM05、非经典型hM06和中间型hM07）也被鉴定了出来；其余的细胞簇根据其高表达CD68，CD和MRC1的特征都被鉴定为巨噬细胞，其中，在肿瘤和正常粘膜中均明显富集（hM08）或在正常粘膜中优先富集（hM09和hM10）的簇为组织驻留巨噬细胞（RTMs），在肿瘤中富集的为TAMs（hM12-hM13）。
研究表明，TAMs既可以起源于RTMs，也可以起源于新募集的单核细胞，这些单核细胞随后会分化为巨噬细胞。通过RNAvelocity分析的扩散图来推断细胞命运，确定了从CD14+单核细胞向FCN1+单核样细胞和其他巨噬细胞群体的强烈定向流动（Figure2E）。接下来作者通过URD和PAGA两种正交算法来进一步破译巨噬细胞的发育分化轨迹，结果表明FCN1+单核样细胞（hM11）可由经不同的RTMs分化为C1QC+和SPP1+TAM细胞（Figure2F）。其中，C1QC+TAM可能通过IL-1b+RTM发育而来，而SPP1+TAM可能由NLRP3+RTM发育而来。然而，要完全阐明发生在肿瘤和正常组织内的巨噬细胞发育轨迹，还需要进行额外的体外细胞分化和体内谱系追踪研究。
Figure2.CharacterizationofTumor-InfiltratingMyeloidCellsbyscRNA-seqinHumanCRC
3.CRC中两群不同功能表型的TAM及细胞间相互作用关系
通过比较TAM群体之间的差异表达基因，发现C1QC+TAM高表达C1Q，TREM2，MERTK和CD80，而SPP1+TAM显示出SPP1，MARCO和VEGFA的特异性表达（Figure3A）。应用GSVA来富集评估两类TAM群中的基因集及参与的信号途径，发现SPP1+TAM中肿瘤血管生成和ECM受体相互作用途径相关基因大量富集，而C1QC+TAM中补体激活和抗原加工呈递途径相关基因集显著富集（Figure3B），这意味着C1QC+TAM主要发挥细胞吞噬和抗原提呈功能，而SPP1+TAM发挥促血管生成及促进肿瘤转移的功能。SPP1+TAM还显示了结直肠腺瘤和转移性肝癌通路的特异性富集（Figure3BandC），提示这类TAMs可能在结直肠肿瘤的发生发展中发挥重要作用。此外，多色免疫组化染色数据也通过对多个marker的检测证实了这两个TAM亚群的存在（Figure3D）。
为了探究CRC中细胞与细胞之间的相互作用，作者结合本研究中得到的scRNA-seq数据和TCGA数据库对各细胞类群进行相关性计算，从而构建出CRC中细胞间相互作用网络（Figure3E）。从关系网中可以发现，TAM和DC作为预测网络的核心节点，与其他细胞类群的相互作用联系最多。两群经典的DC细胞和C1QC+TAM与其他免疫细胞（尤其是T细胞）的相互作用，提示了它们在调节抗肿瘤T细胞免疫应答中也发挥作用。接着，通过引入对受体-配体结合强度的计算，作者模拟推断了介导细胞间相互作用的分子间相互作用（Figure3F）。CXCL10-CXCR3在C1QC+TAM中的显著富集提示了这类TAM可能在招募或激活T细胞中发挥作用，而MMP2-SDC2在SPP1+TAM中的富集提示了这类TAM与肿瘤的生长转移有关。总的来说，这种相互作用分析网络有助于我们更深层次理解髓系细胞在TME中的不同功能。
接下来，作者利用不同的小鼠模型来研究CRC患者与小鼠肿瘤中保守的浸润性髓系细胞亚群。首先分别在MC38和Renca这两种小鼠肿瘤模型中进行anti-CD40和anti-CSF1R的治疗，然后利用10×平台获得小鼠肿瘤浸润免疫细胞单细胞转录组，将数据进行聚类分析后，作者确定了15类髓系细胞亚群（Figure3G）。通过与来自CRC患者的数据相比较，确定了跨物种的多个保守髓系细胞亚群（Figure3H），其中，DC在人和小鼠肿瘤中有较高的一致性，而TAM在小鼠和人之间表现出更大程度的异质性，尽管如此，小鼠肿瘤中也存在与人CRC中相似的TAM亚型（mM11-mM14与C1QC+TAM相似性最大；mM15与SPP1+TAM相似性最大）。
Figure3.DichotomyofFunctionalPhenotypesandPredictedInteractionsofTAMsinHumanCRC
4.CSF1R阻断可导致肿瘤中部分巨噬细胞的耗竭，促血管生成的TAMs对CSF1R阻断治疗有抵抗性
CSF1R是促进髓系细胞增殖和分化的重要受体，目前CSF1R抑制剂处理已是一种重要的靶向髓系细胞的免疫治疗策略，但其单药疗效较差。接下来，作者在单细胞水平阐述了CSF1R阻断的抗肿瘤免疫治疗机理。
相比于对照抗体，用抗CSF1R抗体处理带瘤（Renca）小鼠后，其体内TAM的比例显著降低（Figure4B），同时对治疗前后的肿瘤转录组变化进行分析，发现mM12和mM14细胞群几乎完全丢失，而mM11和mM13变化不大，mM15增多（Figure4CandD），说明不同TAM细胞亚群对anti-CSF1R治疗的敏感程度不同。通过分析不同细胞亚群相关基因的表达，作者进一步研究了TAM亚型对抗CSF1R治疗的敏感性差异是如何改变TME的，结果发现对anti-CSF1R治疗耐受的TAMs高表达参与促血管生成的基因Vegfa和参与免疫抑制的相关基因Cd和Arg1（Figure4E）。这类TAM似乎也与肿瘤血管系统相关（Figure4F），提示其在调节血管生成过程中发挥作用。
接下来，作者评估了TAM增殖是否与anti-CSF1R治疗的敏感性相关。结果发现对anti-CSF1R治疗敏感的TAMs（mM12，mM14）中，细胞增殖必需基因Mki67的表达水平高于治疗耐受的TAMs（mM11，mM13，mM15）（Figure4EandG）。在人CRC肿瘤中，C1QC+TAM也比SPP1+TAM具有更高的增殖评分（Figure4H）。这些数据表明，CSF1R阻断使得处在细胞周期中的巨噬细胞比如C1QC+TAM优先消耗，同时保留SPP1+TAM。为了进一步将在小鼠中的发现与人类CRC相关联，作者比较了具有不同水平C1QC+TAM和SPP1+TAM基因特征的患者存活率，发现低C1QC+TAM和高SPP1+TAM基因特征的组合与CRC患者预后较差的情况相关（Figure4I）。这些发现表明CSF1R阻断治疗后保留了在肿瘤中促血管生成的TAMs，这可能是anti-CSF1R在肿瘤患者中单药疗效较差的一个机制性解释。
Figure4.CSF1RBlockadeLeadstoDepletionofSelectMacrophagePopulationsfromTumors
5、Anti-CD40激动剂治疗促进cDC1细胞群的早期特异性扩增
CD40是TNF受体家族的成员，在DC细胞与T细胞间的信号传递中发挥重要功能。接下来作者重点研究anti-CD40激动剂在抗肿瘤免疫治疗中的作用机制。anti-CD40激动剂治疗可以使MC38小鼠的肿瘤体积缩小，且在与PD-1抑制剂联合使用后可以进一步抑制肿瘤的生长，增强治疗效果（Figure5AandB）。结合CRC患者和小鼠MC38肿瘤模型的单细胞转录组分析，发现CD40在多个DC和巨噬细胞亚群，尤其是cDC1细胞群上高表达，CD40LG在多个CD4+T细胞亚群上高表达（Figure5CandD）。这与之前进行的细胞间相互作用网络分析结果一致，显示了cDC与各种T细胞亚群的广泛相互作用（Figure5E）。
使用anti-CD40激动剂对MC38小鼠进行处理后，第2天进行scRNA-seq的数据分析显示，Ccl22+cDC1细胞迅速做出响应，细胞比例显著增加（Figure5F）。由CD80和CD86表达水平的增强也能显示cDC1细胞的激活（Figure5GandH），此外，anti-CD40处理还增加了cDC1细胞中IL-12的产生（Figure5I）。由此，scRNA-seq分析确定了Ccl22+cDC1细胞为主要受到影响的髓系细胞类型，在anti-CD40激动剂治疗后立即被激活，且anti-CD40介导的DC激活有助于癌症病人的存活（Figure5J）。
Figure5.Anti-CD40AgonistTreatmentIncreasestheFrequencyandActivationStateofcDC1CellsinTumors
6.Anti-CD40激动剂治疗促进效应记忆CD8+T细胞的扩增
对来自MC38肿瘤模型的浸润性T细胞进行scRNA-seq分析，结果显示某些CD4+和CD8+T细胞亚群受到了CD40激动剂处理的影响（Figure6A）。通过使用先前开发的STARTRAC方法来定义T细胞的克隆扩增，迁移和发育转变，发现anti-CD40治疗显著增加了TME中记忆CD8+T细胞亚群的比例，但减少了耗竭CD8+T细胞亚群的比例（Figure6B）。此外，anti-CD40处理显著改变了Lag3+Tex和Mki67+Tex亚型中耗竭标志物的表达谱和动力学，Ctla4和Tigit的表达丰度在处理后迅速降低，在第10天观察到Pdcd1和Lag3的表达显著降低（Figure6C）。流式细胞技术进一步证实了这些scRNA-seq的发现，表明anti-CD40治疗可增加TME中的效应CD8+T细胞并减少PD1+的耗竭CD8+T细胞（Figure6D-G）。通过STARTRAC分析，作者发现anti-CD40处理后Ccl5+TemCD8+T细胞（Tem，效应记忆性T细胞）具有比其他CD8+T细胞亚群更高的迁移指数，在肿瘤和淋巴结之间的迁移能力得到了增强；此外，Ccl5+Tem和Cxcr6+TrmCD8+T细胞（Trm，组织驻留记忆性T细胞）之间的转换指数升高，Tem与Trm细胞间的转换能力在治疗后也有显著的提升，这提示这群Tem细胞可能与stem-likeT细胞相似，具有补充池的功能（Figure6H-J）。
综上所述，研究数据揭示了anti-CD40治疗对肿瘤浸润性Tem和TrmCD8+T细胞的扩增、迁移和转换的独特影响。
Figure6.Anti-CD40AgonistTreatmentIncreasestheFrequencyofCD8+MemoryTCellsinTumors
7.Anti-CD40激动剂治疗诱导Bhlhe40+Th1细胞的活化和扩增
除了上述的CD8+T细胞，anti-CD40激动剂处理对肿瘤浸润性CD4+T细胞亚群也产生了巨大的影响。使用anti-CD40激动剂对MC38小鼠进行治疗后，尽管在第2天Treg细胞显着扩增，但在治疗后第10天Treg细胞的比例又显著降低了；而Bhlhe40+Th1细胞比例都显示特异性地增加，STARTRAC扩增指数也证实了它们的克隆扩增规律（Figure7AandB）。此外，scRNA-seq数据显示，anti-CD40激动剂处理显着诱导了CD40LG在Bhlhe40+Th1细胞上的表达，这一发现也已通过流式分析得到了证实（Figure7C-E）。这些数据表明，CD40激动剂可以通过促进Bhlhe40+Th1细胞表达CD40LG来进一步增强Bhlhe40+Th1细胞与cDC1细胞间的相互作用。
从小鼠MC38肿瘤中分离的Bhlhe40+CD4+T细胞相比别的T细胞表达更高水平的Bhlhe40，且比其他效应CD4+T细胞产生更多的IFN-gamma，通过标记增殖相关markerKi67进行流式分析，发现了CD4+CD40L+T细胞在CD40激动剂处理后被进一步诱导扩增（Figure7F-H）。综合这些发现，作者提出假设：肿瘤浸润性cDC1细胞的anti-CD40激活可能导致产生IFN-gamma的肿瘤浸润性CD4+Th细胞的扩增。体外研究表明，anti-CD40处理可以促进DC细胞的成熟，这进一步增加了CD4+T细胞中Bhlhe40的表达，这与假设是相符的（Figure7I）。进一步分析CRC患者中表达IFN-gamma的Bhlhe40+Th1细胞与cDC细胞的相关性，发现Th1细胞的特征标记与成熟和未成熟的cDC1细胞均显示正相关（Figure7J），这也表明了cDC1细胞与Bhlhe40+Th1细胞之间存在相互作用关系。更重要的是，anti-CD40能诱导Bhlhe40+Th1细胞扩增这一发现可能为CD40激动剂与PD1抑制剂的协同作用提供了一种解释机制（Figure5AandB）。
Figure7.Anti-CD40AgonistTreatmentExpandsBhlhe40+Th1CellsinTumors
总结
该研究对来自结直肠癌患者的免疫和基质细胞群体进行了scRNA-seq分析，在单细胞水平上对患者的肿瘤微环境，特别是浸润髓系细胞亚群进行了系统性的刻画，分析了TAM和DC细胞的亚群功能特征、谱系发育及其与其他细胞（特别是T细胞）的相互作用关系。基于这些结果，该研究分别对接受anti-CSF1R阻断剂和anti-CD40激动剂治疗的小鼠肿瘤模型进行scRNA-seq分析，揭示了这两种靶向髓系细胞的抗肿瘤免疫治疗策略的潜在作用机制，为研究其他人类疾病和开发新的治疗策略提供了思路和方向。
END
扫码
